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无需克隆的CRISPR新技术
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封面故事:CRISPR Cas9 基因编辑工具

仅仅数年间,使用 CRISPR/ Cas9
进行基因组编辑在科研上激起了巨浪,该技术使研究人员能够精确而方便地编辑特定的基因。然而,新技术也存在一些缺点,例如在错误的地点切割
DNA,甚至是随机地进行 DNA 编辑。

来自荷兰Hubrecht研究所和乌特勒支医学中心、麻省理工学院的研究人员称,他们开发出了一种自身克隆CRISPR/Cas9技术,可以绕开基因编辑过程中所有的克隆步骤,在数小时内完成CRISPR/Cas9介导基因突变及位点特异性转基因敲入。他们的研究成果发布在10月29日的《StemCellReports》杂志上。

CRISPR Cas9
基因编辑工具的发展使分子生物学发生了革命性变化。被用来改变病毒、细菌、动物和植物基因组的该工具,具有揭示基因组组织的秘密、对抗疾病、改良作物和培育定制宠物以及很多其他方面的潜力。所有这些都给监管部门造成了需要应对的可怕道德问题,而这一点更因为关于该方法已被用来改变人类胚胎基因组的消息发布而复杂化了。本期《自然》特刊对CRISPR
Cas9
的现状进行调查,并提出这样一个问题:我们希望一个基因被编辑过的世界是什么样子的?

但是科学家们很快开始将 CRISPR
拉回了正确的轨道,如今创新性的分子特性使它更好地作用并能用于更多类型的细胞。CRISPR
应用的迅速出现意味着艾滋病、癌症、镰状细胞病等其他疾病的临床试验出现了端倪。

CRISPR序列源于原核生物的一种获得性免疫系统,协同Cas蛋白家族参与抵抗噬菌体或其他病毒的二次感染,广泛存在于细菌和古细菌中。目前已发现三种不同类型的CRISPR/Cas系统。

大脑导航功能即便在睡眠中也未停止

今天的 CRISPR
技术对于更多研究者来说也是一个尖端的工具,与其他基因调控方法相比,更适应于未来的医疗应用。“回到
RNA 干扰时代,感觉就像进入了超光速飞船。” 整合 DNA
技术公司的高级副总裁和首席科学官 Mark Behlke 说,该公司提供 RNAi 和
CRISPR 的试剂。“但现在 CRISPR
使它看起来像一个孩子的游戏,实在令人惊讶。”

当前,研究人员已将II型CRISPR/Cas系统——CRISPR/Cas9系统改造成为了一种高效的新型基因组编辑工具,它能够以一种位点特异性方式在培养细胞和整个生物体中实现定向修饰特定基因序列。现已在人类、小鼠、斑马鱼、酵母、细菌、果蝇,线虫、拟南芥等物种中得到广泛应用。

几十年的研究表明,哺乳动物导航系统(基于海马体内部和周围)在运动过程中跟踪一个动物的位置。然而过去并不清楚当动物停止运动时大脑是否还跟踪以及怎样跟踪位置。这项研究显示,大脑一直在跟踪位置,不管是在运动中还是在休息时。Loren
Frank及同事在海马体的CA2区域识别出一类截然不同的海马体神经元,它们不仅在清醒不动时,而且在睡眠过程中都传递关于当前位置的信号。

相比于其他基因编辑方法,如 TALENs和锌指核酸酶, CRISPR
更加快捷便宜,也更易于使用,从而快速地被许多领域的科学家所接受。例如,癌症研究人员将包含编码
CRISPR 向导 RNA和 Cas9 的质粒 DNA
转入细胞系中,创造出对应不同研究的癌细胞系。

在CRISPR介导的基因组编辑中,人们设计出一条可靶向目的基因组位点的单导向RNA发夹结构,Cas9蛋白在这条sgRNA的引导下完成对DNA的切割。定点诱变和靶向转基因是发育和疾病研究中重要的手段之一,能够轻易地编辑所有基因组位点可彻底地改变遗传和干细胞研究。

证明Majorana模式存在的新证据

然而斯坦福大学医学院副教授,儿科医生 Matt Porteus 对于 CRISPR
起初有着不同的体验。他说,“每个人都表示 CRISPR
会帮助解决世界上的所有问题,但当我们试图将细胞中的 CRISPR DNA
质粒应用在我们认为重要的治疗中,如造血细胞系或其他原代人类细胞类型,该系统根本不起作用。”
因此,Proteus 实验室研制出的一种在人原代细胞中进行 CRISPR/Cas9
编辑的不同递呈方法, 完全不需要 DNA 质粒。

目前,CRISPR/Cas9打靶要求为每个新位点克隆出一个位点特异性sgRNA质粒,要在大约1周的时间内完成质粒连接、转化、纯化和序列验证等多个耗时且费钱的步骤。这阻碍了需要进行大规模sgRNA筛查的多重及高通量基因组编辑应用。此外,采用CRISPR/Cas9敲入转基因仍然需要费时地构建通常具有600-6,000bp同源臂的同源性载体,这一辛苦费力的过程阻碍了建立基因敲入细胞系。这些障碍抑制了大规模靶向基因组操控革命性的潜力。

费米子有三个已知的基本类型:Dirac, Weyl 和
Majorana。此前,后两者没有被观察到,但关于Weyl和Majorana
模式之存在的证据却在凝聚态物质系统中被发现了。尤其是,Majorana模式的特征在半导体—超导体纳米线器件中被识别了出来,这激起了人们很大兴趣,因为
“non-trivial”拓扑性质过去已经被预测到了。Charles
Marcus及同事为证明Majorana
模式在这些器件中的可靠存在提供了下一个必要证据,即通过增加纳米线长度实现的、以
“能量分劈”的抑制形式出现的对Majorana
模式的指数保护。这些发现为控制Majorana
模式和确定拓扑性质的下一步工作开辟了道路。

该方法的变化在于通过核糖核蛋白形式将 CRISPR/Cas9
试剂引入细胞。“研究人员将这些试剂组合起来,给它们 5 到 10
分钟的时间形成复合体,从而合成出 RNPs。”
赛默飞世尔公司合成生物学研发部高级主管 Jon Chesnut 说,“CRISPR RNPs
可通过脂质纳米粒子或电穿孔的方式传递到细胞中。”

在这篇新文章中,研究人员提出了一种替代性sgRNA和同源性载体生成新方法,其无需克隆质粒,因此大大缩短了时间,减轻了工作量及CRISPR/Cas9介导基因组编辑的成本,而维持了位点特异性突变和转基因插入的高效率。

二氧化碳用作一种化学原料

虽然 RNP 试剂已被广泛使用,但近些年研究人员对它们的兴趣还停留在 CRISPR
方法的层面。“这是由于早期基于质粒的方法中有大量的 DNA
工具被广泛接受,大家还存在意识的盲区。” Dharmacon 公司高级产品经理
Louise Baskin 说。与质粒载体方法相比,无 DNA 的、基于 RNP 的 CRISPR
方法的好处在于没有意外 DNA
的插入,能够降低毒性,对目标效果更好,并且提高了特异性。

这种scCRISPR技术无需为每个靶位点克隆出一条位点特异性的sgRNA或基因敲入同源性载体,可在数小时内完成CRISPR/Cas9介导基因组突变或位点特异性的转基因敲入。研究人员称他们将一种自我切割的回文结构sgRNA质粒,和一条编码所需位点特异性sgRNA的双链DNA短序列导入到靶细胞中,使得它们能够通过同源重组生成位点特异性sgRNA质粒。每个靶位点只需2小时准备时间,相比于基于质粒构建sgRNA,scCRISPR可以低近6倍的成本有效地实现基因敲除。随后,研究人员在小鼠和人类胚胎干细胞及HEK293T细胞中证实了它们的基因组编辑效率。

认为温室气体二氧化碳也许可用作一种化学原料的观点是有吸引力的,但通常也不实际——尽管它很容易与以碳为中心的亲核试剂发生反应,但生成亲核试剂却需要高能量输入。但是现在,受RuBisCO酶(该酶催化植物的固碳反应)的启发,Aanindeeta
Banerjee等人显示,在中等温度下含有碱金属的熔融盐,能使非常弱酸性的C-H键在碳酸盐帮助下高效发生羧化作用。这一化学反应的潜力通过将2-糠酸(很容易从不可食用的生物质制取)转化成有用的生源化学原料
“呋喃-2,5-二羧酸”得到了演示。

这些优点使得无 DNA 的 CRISPR
工具更适合于在治疗中应用。“对我们来说,在原代组织和原代细胞类型中的基因编辑能力是一个巨大的突破。”
加州大学旧金山分校细胞与分子药理学博士后 Judd Hultquist 说。

这种新方法大大简化了生成靶向转基因或基因敲除细胞系的过程,且不影响效率,由此为大规模基因组编辑和筛查应用提供了一个理想的平台。

气候敏感型生态系统被发现

通过与 Kathrin Schumann合作,Hultquist 将 Dharmacon 公司 Edit-R 合成
gRNAs 的 RNPs 用在人原发性 T
细胞中,该细胞是艾滋病病毒的主要目标。现在他们正在开发一种基于 RNP
的平台,目标在于寻找能够提高 T 细胞对 HIV 感染抗性的遗传变化。

气候变化研究中的一个关键问题是,怎样识别对气候变化最敏感的生态系统。这项研究利用在2000年2月和2013年12月间收集的MODIS卫星数据来建立一个新的评价指标,即
“植被敏感度指数”,它所测定的是生态系统对三个关键的气候变量——气温、水可获得性和云层——的外部作用力的反应。该指数可被用来在全球尺度上以高空间分辨率识别生态系统的恢复能力状态。对气候变化的敏感度大的区域在中亚、北美和南美的北极冻原、北方雨林和热带雨林、高山地区、稀树荒原和草原地区、南美东部的
“卡廷加”落叶林以及澳大利亚的东部地区明显存在。

CRISPR
的核糖核蛋白的使用也彻底变革了模式动物系统。对于秀丽线虫而言,CRISPR
是一个真正的游戏改变者。” 华盛顿大学医学研究所副教授 Brian Kraemer
说,他是 IDT 公司的无 DNA CRISPR 试剂的使用者。

性使得自然选择更高效

将核糖核蛋白注入到线虫性腺区,可以进行生殖细胞的基因组编辑,随后可以分离出具有编辑表型的后代进行后续研究。Kraemer
的实验室利用线虫作为模式去识别蛋白质聚集疾病的致病机制所需要的基因。

对有性繁殖尽管代价大却又普遍存在的事实做出解释,是演化生物学中一个长期未能解决的著名问题。理论和一些实验研究都提出了各种机制,如克隆干涉的降低或减少有害突变
“搭便车”的能力的降低等。以酿酒酵母的实验演化作为一个模型系统,Michael
Desai及同事对有性和无性种群的适应性在序列层面的动态进行了对比。他们发现,有性繁殖通过减少有益突变之间的克隆干涉提高适应性,改变被自然选择固定的突变类型。这样的净效应是,有性繁殖会加快适应过程,让自然选择更高效地将有益突变从有害突变中分选出来。

Kraemer 认为,新的 CRISPR
工具将引燃下一代线虫转基因模型,包括定制等位基因,依照实验的目的而改变基因编码蛋白,例如通过改变胞内转运蛋白的靶序列,可以使它定位到一个不同的细胞膜区域。

提高原代细胞CRISPR 的关键之一,是近期的增强试剂。IDT
公司开发了经过化学修饰的能够在胞内抵抗核酸酶降解的
gRNA。该公司还开发了两个短的 RNA 形式的
gRNAs,能够形成复合体,而不是单一的、更长的 gRNA。MilliporeSigma
公司也计划提供称为 “SygRNAs” 的两部合成 gRNAs。

牛津大学威廉邓恩爵士病理学院的基因组工程平台负责人 Joey Riepsaame,采用
IDT 公司的 Alt-R CRISPR/Cas9 RNP 系统来辅助进行基因编辑实验。Riepsaame
称赞 IDT 公司的两步合成
gRNAs,能够减少诱发不必要的免疫反应。“这对我来说是一个非常重要的因素,因为我的项目涉及到使用
CRISPR/Cas9 纠正免疫细胞中疾病诱发的突变。”
他说,“到目前为止,我们还没有在 CRISPR/Cas9
中遇到任何重大的挑战,并且能够靶向到每个感兴趣的区域。”

优化的 CRISPR 试剂,如 RNPs 也给研究人员提供新的机会。以 DNA 为基础的
CRISPR的一个问题,是在开始编辑前存在一个滞后阶段,这期间细胞机制会转录和
/ 或翻译活性 CRISPR 试剂。例如,将基于 DNA 或 mRNA 的 CRISPR
试剂注射进胚胎中时,结果能够产生一种称为
“镶嵌体”,也就是具有超过一种的遗传信息的动物。“RNP
的方法能够降低镶嵌现象,因为它的试剂在引入的同时就被激活,在编辑后快速降解,同时对于降低脱靶效应也有好处。”
IDT 公司的 Behlke 说。

其他的新工具,包括用于将 CRISPR
试剂更好的传递到细胞中的转染试剂。MTI-GlobalStem 公司新的 EditPro
干细胞转染试剂能够将 CRISPR 工具传递到细胞中,而他们的 EditPro
转染试剂能够传递进人类原代细胞以及细胞系。“新的 EditPro 转染试剂依照
mRNA 的量,具有广泛的可调节剂量。”MTI globalstem 公司科学总监 James
Kehler 说

除了优化 CRISPR 试剂,研究人员也正在以新的、创造性的方式来使用
CRISPR/Cas9 系统。例如,去除 “剪刀” 功能的 Cas9
变成一种有效的分子靶向的工具,可以将附加效应分子靶向到基因组的特定区域。不同的效应分子,如激活子、抑制子或者修饰子也已经被研究。MilliporeSigma
公司的 dCas9-p300 激活子就是一个融合了 p300
组蛋白乙酰转移酶结构域的非切割版本的
Cas9。一经结合,该激活子能够使附近的组蛋白乙酰化,为增强和持续的基因表达打开了染色质。

尽管基于 RNP 的 CRISPR
技术在近期大获成功,在用于功能筛选时,基于质粒技术还是存在一席之地。为了鉴定引发疾病的基因,一些公司提供了基于慢病毒
CRISPR 的基因敲除文库。美国西北大学费因伯格医学院小儿神经外科副教授
Simone Treiger Sredni 近期利用赛默飞世尔科技公司的 LentiArray CRISPR
文库去筛选 160 种影响细胞增殖的激酶的突变。Sredni
研究主要集中在寻找与儿童非典型畸胎样 / 横纹肌样瘤(atypical
teratoid/rhabdoid tumors ,AT/RTs)
的治疗方案,这是一种侵入性和致死类型的儿童脑瘤。

Sredni 在一些特定的激酶中筛选了一致的突变,能够减少 AT/RT
细胞系的细胞增殖。她说,“其中一种激酶的抑制剂能够与缺失基因产生同样的效应,使得肿瘤不再生长。”
她也观察了利用高通量的基因表达平台进行的筛选,“这个基因从此不起作用了,因为它的表达水平是非常低的。”
接下来,Sredni 将研究抑制剂在小鼠移植瘤中的效应。

MilliporeSigma 公司还提供了基于慢病毒的,用于全基因组筛选 CRISPR
工具。通过与惠康基金会桑格研究所合作,MilliporeSigma
最近还为人类和小鼠的基因组构建了阵列式的全基因组 CRISPR
文库的,提供的格式、传递方式和范围都很灵活。

安捷伦公司日前也发布了集合性 CRISPR 筛选指导库,包括通过慢病毒载体传递的
CRISPR
基因敲除文库,包括了人类和小鼠的基因组尺度。为了获取充分的灵活性,安捷伦还提供了前扩增和不扩增的用户定制文库。“我们的
CRISPR 集合库利用 CRISPR/Cas9
在整个基因组上进行敲除,在功能筛选中被广泛使用。”安捷伦公司分子和合成组诊断和基因组生物学全球营销总监
Caroline Tsou
说,“通常这种敲除用来确定参与的细胞反应的基因,如信号转导通路,或发现新基因的功能。”安捷伦还提供长达
230 个碱基对的定制化的寡核苷酸,能给研究者 “探索文库其他用途的自由。”
她说。

但有时当细胞在被迫表达细菌核酸酶时,状态都不是太好。Dharmacon 公司的
Edit-R 诱导慢病毒 Cas9
系统对于那些不愿意在稳定细胞系中长时间含有核酸酶的研究人员来说,是
“一个很好的妥协。”
巴斯金说。“诱导系统发挥了最好的一面,因为当准备使用向导 RNA
处理细胞时,他们可以开启核酸酶的表达,得到充分表达的
Cas9,随后在完成切割后再将它关闭。”

与此同时,各种各样的 CRISPR 试剂已经为了对抗疾病准备就绪,特别是使用无
DNA 的方法。比如,RNP 方法的快开、快关的特性非常适合治疗性应用,CRISPR
试剂可以定向切割随后迅速降解。

但是纠正基因缺陷并不像敲除基因那么容易,因为通常行使功能的基因也必须被引入到正确的位置上。位于斯坦福的
Porteus 实验室最近发表了概念验证的 CRISPR RNPs,用于靶向β-
球蛋白基因,该基因的突变导致镰状细胞病。他们发现 CRISPR
可以修正这种疾病患者的人类造血干细胞中的β-
珠蛋白基因缺陷。此外,在加州大学伯克利分校的一个实验室独立地完成了一个类似的
CRISPR 编辑β珠蛋白基因的结果,使用稍微不同的方法来进行基因修正。

综合起来,这些工作给即将进行的人体临床试验带来了福音。2016 年 6
月,美国国立卫生研究院在美国批准的第一个临床试验,将使用 CRISPR 编辑人类
T 细胞帮助改善癌症治疗,预计该实验要持续到 2017 年。

同时,Porteus 实验室正在着手将 CRISPR
编辑的细胞用在病人身上,他们期望能在 2018
年开始临床试验。他们可能首先针对镰状细胞病,其次是严重的联合免疫缺陷。Porteus
实验室不仅希望利用 CRISPR
修正突变,同时能够给细胞增加新的特性,从而可以治疗疾病,“例如抗 HIV
的免疫系统,或创建能够传递蛋白质到脑部的细胞。”
他说。“在科学和医学的生态链中,我们觉得自己的角色应该是将这些技术带给病人。”

随着 CRISPR
研究工具的飞速发展,以及将于近期开始的临床试验,我们与目标的距离可能比想象中更近。

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