大肠杆菌开拓记

大约两分钟前,我空降在了一片未被开发过的区域。这片区域看起来有着相当丰富的营养,尽管有阻力,但我还可以向周围运动。这看上去是个繁殖的好地方。我是一个大肠杆菌(Escherichia
coli
),大概20分钟后,我将会有第一代后代,而它还会进一步产生更多的“我”——有的时候,我们长得不完全一样,但毕竟也是我的子孙嘛。相信很快我们就能占领这片区域。

44个小时过去,这片地方已经全是我和我的后代们的了。那些去得比较远的先行者告诉我,远方还有未经开发的区域,但是那片区域似乎被什么东西污染了,它们感到很难受。可如果只在这里呆下去,营养也会被用完的。我的后代们必须做出觉悟。

现在,距离刚来的时候已经88个小时,那个有毒的区域还是被新的后代适应了!它们跟老家的先辈们比起来更不一样了。后来的一部分小家伙看上去具有更高的耐性,但早被勇敢的先行者们堵在了后面,这个问题看上去很难解决。先要加把劲占领这里再说吧。

第132小时,上一片区域也被占满了。我们不得不来到新的地方——地方很大,但也更加危险。不过我们已经有了应对的经验,就这么繁殖下去,反正总会有个别新家伙有办法适应。这不,我们来了。

第176小时,我们似乎陷入了绝境。许多先行者死在了更远的区域,为什么会这样?那片区域的污染太严重了,可脚下这个区域的营养已将耗尽了!它无法再容纳我的后代了!该怎么办?

没想到终于还是到达了这个被重度污染的区域!第220个小时,天知道我对自己的身体做了什么。我感觉到自己显然没有之前那么健康了。我的同行者更少了,身边大部分同类都死于这些该死的污染。但我还活着,相信它们也会想到办法跨过这道坎。我们还能制造更多的后代。

哈哈,早已大不相同的我和我的后代们终究还是在这片地方兴盛了起来。现在是第264个小时,这里的毒素对我们来讲已经不再是任何问题。少部分先行者已经到达了更远、含有更高浓度毒素的区域,依然有许多同类在死去。可那又怎么样?等着吧,我们一定能征服那片区域的。

1、前言

大肠杆菌是埃希氏菌属中最重要的一种细菌,属于革兰氏阴性兼性厌氧杆菌。随着时间的推移,大肠杆菌的耐药率大幅度上升,多重耐药菌株剧增,耐药谱增宽,大肠杆菌的耐药问题已成为影响人类健康和养殖业发展的重要因素。近年来,集约化养禽场的其他疾病得到基本控制,但大肠杆菌病有明显的上升趋势,主要表现为大肠杆菌的耐药能力不断增强,使大肠杆菌病的动物临床用药选择空间不断缩小,治疗效果也很难保障。因此,对源大肠杆菌的耐药性进行监测与分析,对于指导临床合理用药及控制该病的流行非常重要。近年来,埃希氏大肠杆菌的耐药性呈上升趋势,关于大肠杆菌对抗生素的耐药性问题,已在世界范围内引起重视。
1材料和方法
1.1试验菌株
无菌采集病死鸡的心、肝、脾、气囊、十二指肠等,蘸取脏器的横切面组织液:
1.2培养基
LB培养基:蛋白胨1.2 g、酵母粉0.6 g、氯化钠1.2 g、用蒸馏水补充至120
ml。麦康凯琼脂培养基:称取麦康凯琼脂粉末54 g,加入1 000
mt蒸馏水中,加热煮沸溶解,分装,121℃高压灭菌15 min备用。
1.3 器材与试剂
超净工作台,无菌96孔板,恒温振荡器,酶标仪,微量可调移液器,隔水式恒温培养箱,蛋白胨,酵母提取物,TTC粉剂,NaCl,麦康凯琼脂。
1.4试验方法
1.4.1
大肠杆菌的筛选与培养从采取的病料中钩菌划线于麦康凯琼脂平板上进行细菌培养与分离,置于37℃恒温箱中培养20~22
h观察生长情况,选定具有大肠杆菌菌落特征的可疑菌落继续进行培养保存。直至
呈现单一的中间深红外周桃红色、圆形、边缘整齐、光滑、湿润、中等大小的菌落。
1.4.2药敏性测定采用96孑L板微量稀释法将抗菌药物稀释成最终浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、4ug/ml、8ug/ml、16ug/ml、32ug/ml、64ug/ml、128ug/ml8个梯度浓度,加入菌悬液后将96孔板摇匀,然后放置在37℃恒温培养箱中培养20
h,再将96孔板各个附孔各加20ulTTC染色,摇匀,37℃静置4
h后吸出各附孔中的上清液,加200ul二甲基亚砜溶解剩余的不溶络合物,用酶标仪测吸光度。
1.4.3联合用药选药敏性差的抗菌药物分别与舒巴坦钠和乙二胺四醋酸联合用药,再测抗菌药物与舒巴坦钠和EDTA同时联合用药,使加入的舒巴坦钠与抗菌药的浓度比为2:1,EDTA的最终浓度为512ug/ml,测定EDTA和舒巴坦钠单独与抗菌药物联用时对抗菌药物抗菌活性的影响,及同时与抗菌药物联用时对活性的影响。
1.5结果判定
抗菌药物对大肠杆菌的抗菌活性用最终算出的最低抑菌浓度来判定。用联合用药的抗菌活性与单一用药时抗菌药物的抗菌活性对比,抑菌效果高于4倍或4倍以上的说明EDTA或舒巴坦钠对抗菌药的活性有影响。
2试验结果
根据药敏性在药物最高浓度未达到MIC的及在128ug/ml时对应的最大抑菌率由小到大的顺序见表1。
根据MIC值对抗菌药物进行药敏性由高到低进行排序,结果见表2。
根据MIC值对抗菌药物进行药敏性由高到低进 行排序,结果见表3。
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3结果分析
3.1单一用药试验结果分析
药敏试验结果显示在21个抗菌药物中有5个药物的抑菌效果已经很不明显,对此大肠杆菌基本丧失了抑制作用。剩下的16个抗菌药的抑菌率都可以达到MIC值,保持一定的抗菌作用,占总药物数量的76.2%;只有6个药物抗菌能力可以达到MIC值,具有很高的抗菌活性,占总药物的28.6%。可见此株大肠杆菌对卡那霉素、盐酸恩诺沙星、盐酸环丙沙星、头孢拉定和庆大霉素等药物同时产生了很高的耐药性;对盐酸黄连素、痢菌净、曲松钠、磺胺六甲嘧啶钠、盐酸头孢噻呋、磷酸素钠、盐酸土霉素、阿莫西林、乳酸诺氟沙星等药物有较高的敏感性,对这些药物的耐药能力还不是很明显;而对利福平、强力霉素、氟苯尼考、头孢噻肟钠、乳酸左氧氟沙星和痢菌净等药物有很高的敏感性,尚未对这些药物长生耐药性。
3.2联合用药试验结果分析
卡那霉素的联合用药数据显示:卡那霉素与EDTA联用其抗菌效果整体有明显的提高,随着卡
那霉素浓度的增加,抗菌活性呈稳步提高趋势,但是提高的幅度并不大,卡那霉素的浓度在1ug/ml和128ug/ml的抑菌率分别是69.05%和80.60%;卡那霉素与舒巴坦钠联合用药的抑菌效果随卡那霉素和舒巴坦钠的浓度提高(抗菌药物:舒巴坦钠=1:2)有大幅度的提高,卡那霉素浓度在16ug/ml时的抑菌率达到52.72%,卡那霉素浓度为128ug/ml时抑菌率达到99.20%,卡那霉素与EDTA和舒巴坦钠同时联合用药的抑菌率提高的更加明显,卡那霉素浓度在1ug/ml的抑菌率可达74.03%,在16ug/ml浓度时的抑菌率可达到91.85%,而在卡那霉素单一用药浓度为128ug/ml时的抑菌率只有30.85%,所以,与卡那霉素单一用药相比,EDTA和舒巴坦钠分别或同时与卡那霉素联合用药时,对卡那霉素的抗菌活性均有很大的影响。
盐酸恩诺沙星联合用药数据显示:盐酸恩诺沙星与EDTA联合用药的抑菌效果整体提高很多,抑菌率随盐酸恩诺沙星的浓度提高而稳步提高,盐酸恩诺沙星浓度在1ug/ml时候的抑菌率已经达到61.34%,在64ug/ml时的抑菌率达到97.37%;盐酸恩诺沙星与舒巴坦钠联用的抑菌效果随药物浓度的提高有大幅度的提高,盐酸恩诺沙星的浓度在8ug/ml时,抑菌率达到55.63%,浓度在32ug/ml时的抑菌率达到93.67%;盐酸恩诺沙星与EDTA和舒巴坦钠同时联用的抑菌效果提高更加明显,在盐酸恩诺沙星的浓度为1ug/ml时候的抑菌率可高达74.97%,32ug/ml的药物浓度抑菌率可达99.24%,而在盐酸恩诺沙星单一用药浓度为128ug/ml时的抑菌率为32.96%,所以与盐酸恩诺沙星单一用药相比,EDTA和舒巴坦钠分别或同时与盐酸恩诺沙星联合用药时对盐酸恩诺沙星的抗菌活性均有很大的影响。
盐酸环丙沙星的联合用药数据显示:盐酸环丙沙星与EDTA联合用药的抑菌率整体有明显的提高,但随着盐酸环丙沙星的浓度增加其抑菌率的提高并不是很明显,盐酸环丙沙星的浓度在1ug/ml和128ug/ml的抑菌率分别是73.54%和86.25%;盐酸环丙沙星与舒巴坦钠联合用药的抑菌效果随盐酸环丙沙星的药物浓度的提高有大幅度的提高,盐酸环丙沙星的浓度在1ug/ml和128ug/ml的抑菌率分别是7.02%和99.80%,可见药物浓
度对抑菌效果有很大影响,但是在药物浓度低于16ug/ml时盐酸环丙沙星与舒巴坦钠联合用药的抑菌率却比单一用盐酸环丙沙星的抑菌率低,而在浓度大于16ug/ml时的抑菌率提升非常大,盐酸环丙沙星的浓度在32ug/ml时抑菌率达到98.98%,可见盐酸环丙沙星与舒巴坦钠联合用药在药物浓度超过16ug/ml时才有提高抗菌活性的作用,并且作用很明显。盐酸环丙沙星与EDTA和舒巴坦钠联合用药的抑菌效果不但对整体作用有提高,而且随药物浓度提高呈尾部提高的趋势,药物浓度在1ug/ml时的抑菌率为74.22%,在16ug/ml时的抑菌率达到92.34%,而盐酸环丙沙星单独用药时在浓度为128ug/ml时的抑菌率为43.89%,所以与单一用药相比,EDTA和舒巴坦钠分别或同时与盐酸环丙沙星联合用药对盐酸环丙沙星的抗菌活性均有很大的影响。
头孢拉定联合用药数据显示:头孢拉定与EDTA联合用药的抑菌效果整体有很大提高,但是随头孢拉定的药物浓度的增加对应的抑菌率提高幅度却很小,头孢拉定的浓度在1ug/ml和128ug/ml的抑菌率分别是60.42%和85.93%;头孢拉定与舒巴坦钠联合用药的抑菌率随药物浓度呈大幅度的提高趋势,但是在头孢拉定的浓度为128ug/ml时的抑菌率只达到65.46%,较单一使用头孢拉定时128ug/ml的抑菌率为45.74%比,抑菌率的提升并不是很明显,由于联合用药时药物浓度在32ug/ml时的抑菌率为57.56%,比单一用药时128ug/ml抑菌率为45.74%的抑菌率要高,舒巴坦钠使头孢拉定的抑菌活性提高超过4倍,所以舒巴坦钠对头孢拉定的抗菌活性有影响。头孢拉定与EDTA和舒巴坦钠联合用药的抑菌率整体上有很大的提高,随药物浓度的提高抑菌率提高范围不大,头孢拉定浓度在1ug/ml时候抑菌率为73.20%,
在16ug/ml时抑菌率达到93.65%,头孢拉定单一用药时浓度在128ug/ml时的抑菌率为45.74%,所以,EDTA和舒巴坦钠同时与头孢拉定联合用药对头孢拉定的抗菌活性的影响非常大,而舒巴坦钠与头孢拉定联合用药对头孢拉定的抗菌活性影响较小。
综上所述,EDTA可以使抗菌药物的活性有很大的提高,抗菌药物浓度在1
Ixg/ml时的抑菌率可到达60%以上,对大肠杆菌病具有较强的治疗效果,并且EDTA的市场价格很低,适合于工业生产和养殖户的大规模使用;舒巴坦钠的抑菌效果随浓度的增加而增加,一般在药物浓度为16
ug/ml时候抑菌率才可以达到50%以上,但是不同药物对舒巴坦钠的影响效果不同,并且舒巴坦钠的市场价格较贵,不适合大规模使用。
4讨论
该试验的药敏数据一方面为该地区的用药提供了一定的参考价值,另一方面也显示了该地区动物源性大肠杆菌的耐药性极其严重,有必要对本地区动物源性细菌的耐药性进行跟踪监测。由于各地区的养殖模式和用药习惯不同,导致细菌的耐药性也存在一定的差异,所以各地区要根据实际情况对本地区细菌的耐药性进行监测和抗菌药的用药管理。另外,通过对耐药菌的耐药机理研究,合理搭配药物使失去抗菌活性的药物重新恢复抗菌能力,从而有效控制细菌耐药谱的扩增。

培养板上的演化之路

上面这个大肠杆菌的故事,发生在哈佛医学院罗伊·契肖尼(Roy
Kishony)“平板演化”实验上。在不足两周的时间中,它演化出了耐受高浓度抗生素的能力。在受到耐药菌威胁的今天,科学家正在两个方面进行努力——一部分科学家在尝试研发更多的抗菌药物;而另一部分科学家,包括契肖尼,则在试图搞清楚这些生物的能力究竟是怎么来的。根据契肖尼和同事在《科学》上发表的文章,大肠杆菌从普通病原到抗药性极强的细菌的转变,只需要12天的时间。

大肠杆菌所处那片广袤而受到不同程度污染的“土地”,是契肖尼和他的小组为了模拟微生物适应演化,设计的一个“软平板”。他们把这个装置称为“微生物演化与成长板”(microbial
evolution and growth
arena,MEGA)。这块体积达到了120×60厘米的巨型培养板由两层琼脂培养基构成。位于下层的培养基固体,成分不会自动扩散,因此研究人员可以按照自己的需求设置不同的抗生素浓度形成梯度。而位于上层的软琼脂培养基使得细菌不会像在正常的固体培养基上被“固定”成一个一个菌落,它们能够沿着这块板进行游动,扩散到它们能够生存的区域。契肖尼在整块下层琼脂平板上注入了黑色的墨水。大肠杆菌在形成菌落时会盖住下方墨水的颜色,这样,研究人员就能够直观地看到它们最终能走到哪里。

betway88 4契肖尼的MEGA板。图中这一块是用于观察甲氧苄啶(TMP)适应进化的MEGA板,在MEGA板两侧添加的大肠杆菌将扩散到MEGA板中央含有高浓度TMP的区域。图片来源:参考文献[1]

契肖尼准备了两套这样的“竞技场”。除了两段的接种区,“竞技场”的其他区域分别含有不同浓度的甲氧苄啶(Trimethoprim,TMP)和环丙沙星(Ciprofloxacin,CPR)两种常见的抗生素。在TMP板中,它们的最小浓度单位为3个最小抑菌浓度(MIC)——1个MIC的量,就能够抑制大肠杆菌的生长。而当大肠杆菌们成功适应了3MIC的梯度后,它们还将面临30/300/3000倍MIC的“高山”。而在CPR板中,这个数字有所减小,但如果要使子孙覆盖整个“竞技场”,大肠杆菌也最终需要征服高达2000MIC的浓度才行。

而结果你已经知道了:那些大肠杆菌不但适应了对它们来说极为致命的抗生素浓度,而且速度是惊人的——12天和15天,这是它们分别攻克TMP和CPR板最高抗生素浓度区所花的时间。

betway88 5大肠杆菌(白)在TMP板上12天的培养过程。图片来源:参考文献[1]

而这实在是太快了。

氟苯尼考(Florfenicol)是一种化学合成的酰胺醇类广谱抗菌药,最早于1979年上市,中国于1999年批准使用,用于治疗敏感菌引起的猪等动物的细菌性疾病。其作用机理是通过与细菌核糖体50s亚基结合,抑制细菌蛋白质的合成,起到抗菌作用。该药具有抗菌谱广、吸收良好、体内分布广泛,相对比较安全的特点,在养猪生产上,广泛用于防治大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性巴氏杆菌、各类链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌等所致的多种细菌性疾病,尤其是在猪呼吸道疾病控制中(马建云,2005;许瑞,2011)。

超级抗性是怎样炼成的

为了弄清楚大肠杆菌快速演化的背后发生了什么,契肖尼在含有TMP的MEGA板上随机挑选出位于不同梯度的菌落进行基因组测序,来搞清楚这些适应性背后的机制。按照测序的结果,研究人员将“变异菌群”分为两组:含有超过60个基因突变的高突变组,以及基因突变不超过12个的低突变组。

betway88 6在MEGA板上采集的样本会用于基因组测序。图片来源:参考文献[1]

在所有高突变组中,一个被称为dnaQ的基因都出现了变异。这一基因负责编码DNA聚合酶III,在DNA复制的校对中扮演着关键角色。dnaQ的失活意味着细菌的DNA的复制会变得错误百出。在没有抗生素压力的“和平年代”,这样的不稳定会为菌落的持续生长增添额外的负担。但此时此刻,更多的错误将意味着更多的可能性——包含那些能够适应抗生素的可能。这部分可能带给整个大肠杆菌群落更大的生存几率。然而,这样的大肠杆菌抵达最高抗生素浓度区域的时间与低突变组的菌大致相同,这让研究者将分析的焦点放在了低突变组。

在低突变组中,一个名为folA的基因被反复突变掉。folA是二氢叶酸还原酶的编码基因,也是抗生素TMP作用的直接位点。这一基因的失活,可能将使得TMP无处着力。除了folA之外,一些与TMP抗性并无首要关联的基因也发生了突变。这其中包括与大肠杆菌应激反应相关的betway88,marsox,以及许多与TMP抗性相关的转录和翻译元件。

尽管这样的突变能赋予大肠杆菌更强的抗药性,但大部分时候,这都会以牺牲自己的生长速率为代价。在适应的初期,它们的生长速率会明显放缓。可即使这样一个短暂的“刹车”,也会对大肠杆菌造成巨大的影响。不过,在适应了筛选的环境后,细菌们又会找到办法回复之前的生长速度。MEGA板上空间有限,对于单个大肠杆菌菌落来说,复制一旦放缓,竞争者就会“超车”跑到它的前面。契肖尼发现,在抗生素梯度“边界”处的大肠杆菌,往往并非那些最能耐受抗生素的菌群。那些能够耐受最高浓度抗生素的菌群,往往会由于空间不足被硬“挤”在低浓度抗生素区——把这类“怀才不遇”的菌群移到抗生素浓度梯度的边界上,它们能够扩散更远的距离。

值得注意的是,尽管大肠杆菌在所展现的适应能力令人咋舌,但契肖尼和同事的其他实验,那些“一步登天”——能够直接从0跳到在最高浓度抗生素压力下存活的细菌并不存在,适宜的“中间浓度”也许是发生适应性进化的必要条件。

betway88 7不同浓度设置下的TMP抗药性实验。t为培养时间。图片来源:参考文献[1]

MEGA板的存在使得人们得以在空间和时间两个维度来直观地观察细菌抗药性的演化史,这也促使人们进行思考未来如何更加有效地与之对抗。对抗生素和耐药菌之间关系的研究有很多,但人们很少意识到的是,在一个真实的环境中,演化程度并非决定种群密度的唯一优势。一些时常被人忽视的因素,比如复制速度和菌群密度,都可能成为耐药菌传播扩散的桎梏。借助更多这样的信息,科学家们也许能够发现更为恰当的对策应对耐药菌的威胁。

(编辑:Calo)

副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌是猪的两种重要的细菌性病原,尤其在猪呼吸道疾病的混合感染中起到重要作用。副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)由德国学者Glasser发现,于1910年首次报道,至少具有15个血清型,导致多发性浆膜炎,包括胸膜炎、腹膜炎、心包炎、关节炎和脑膜炎等。副猪嗜血杆菌病是规模化养猪场最常见的细菌性疾病,在猪群的分离比例仅次于链球菌,占比22.5%。胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)由Pattison于1957年首次报道,到目前为止已知有15个血清型,胸膜肺炎放线杆菌是生长育肥猪群的重要病原,常导致猪只猝死、胸膜肺炎和生长不良。由于HP和APP血清型众多,疫苗免疫常常面临交叉保护作用不强的问题,影响其防控作用,所以抗菌药物成为控制这两种病的主要手段,临床上,氟苯尼考是控制这两种疾病的最常用的抗菌药之一。

参考文献:

  1. Baym, Michael, et al. “Spatiotemporal microbial evolution on
    antibiotic landscapes.” Science 353.6304 (2016): 1147-1151.

随着氟苯尼考在猪细菌性疾病,尤其是HPS和APP控制中的大量广泛使用,因此导致的细菌耐药性也逐年上升,使耐药菌株流行(Kucerovaetal2011,Vannietal2012)。其中国内已有报道重庆部分地区副猪嗜血杆菌对氟苯尼考的耐药率达到29%(魏光河和黄伟2012),湖南部分地区的胸膜肺炎放线杆菌对氟苯尼考的耐药性也已达到20%,给疾病的治疗和控制带来了很大的挑战和威胁,寻找合理的联合用药已成为控制耐药菌感染和延长现有抗生素使用寿命亟待解决的问题。因此本研究筛选与氟苯尼考联合用药具有协同作用的抗生素,为APP和HP感染的治疗提供更多依据。

文章题图:参考文献[1]

2材料与方法

2.1试验菌株

副猪嗜血杆菌SH0165株为血清5型的地方分离强毒株,胸膜肺炎放线杆菌JL03株为血清3型的临床分离株,均由华中农业大学农业微生物国家重点实验室动物传染病分室提供。两种细菌均在添加8%胎牛血清和5‰NAD的TSA固体培养基或TSB液体培养基中生长。

2.2培养基及试剂

胰蛋白大豆琼脂和胰蛋白大豆肉汤购自英国OXOID公司;四季青无菌胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸购自美国Sigma公司,配制成1mg/ml的储存浓度,过滤除菌备用。

氟苯尼考:江苏恒盛药业有限公司生产,批号FB1503032;盐酸多西环素:扬州联博药业有限公司生产,批号YD141001100;硫酸粘杆菌素:山东鲁抗舍乐里药业有限公司生产,批号1411016;甲氧苄啶:寿光富康制药有限公司生产,批号YR20140173。称取适量的以上四种抗生素,溶于相应量的溶剂中,使浓度为5120μg/mL,过滤除菌,-20℃保存。

2.3体外MIC的测定

按照临床实验室标准化委员会推荐的肉汤微量稀释法进行。将待测菌株分别接种液体培养基,37℃振荡培养至OD600≈1.0(相当108CFU/ml),用液体培养基校正菌液浓度至0.5麦氏比浊管浓度,将菌液稀释到107CFU/ml,备用;在96孔板中TSB培养基,在第一孔加入适当体积的抗生素储存液,后续孔进行2倍梯度倍比稀释;将之前稀释好的菌液加入微孔板中,使菌液终浓度达到105CFU/ml,每孔总体积为100μl。同时做阴阳性对照,37℃培养APP16-20h和HPS48h,读取抗生素对菌株的最小抑菌浓度即为MIC,每次试验3个重复,重复三次。

2.4联合用药的体外抑菌试验

用棋盘法测定氟苯尼考与多西环素、粘杆菌素和TMP联合的体外抑菌活性。将储存浓度的抗生素配制成2.5、5、10、20、40倍MIC的浓度,参照MIC测定的方法,分别将两种抗生素加入到同一个孔中,使各孔中的药物最终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4倍MIC的浓度。另设阳性对照和阴性对照。重复棋盘试验3次,每次3个重复。氟苯尼考与其他抗菌剂的联合用药试验以抑菌浓度指数(Fractionalinhibitoryconcentration,FIC)作为判断依据(曾令兵1997,吴亮等2008)。FIC的计算公式为:

FIC=甲药联合时的MIC/甲药单独时的MIC+乙药联合时的MIC/乙药单独时的MIC

当FIC≤0.75时判为协同作用,1.00≥FIC>0.75时判为相加作用,2.00≥FIC>1.00时判为无关作用,FIC>2.00时判为拮抗作用。

3结果

3.1抗生素单用MIC的测定结果

氟苯尼考、多西环素、TMP和粘杆菌素单用对副猪嗜血杆菌SH0165株和胸膜肺炎放线杆菌JL03株的抑菌MIC较小,均≤1μg/mL,根据临床实验室标准化委员会的判定标准均为敏感。而副猪嗜血杆菌SH0165株对TMP的MIC为8μg/mL,属于耐药,详见表1。

3.2抗生素联用MIC的测定结果

采用棋盘法对两种药物联合使用的体外最低抑菌浓度进行了测定,结果见表2和表3。其中氟苯尼考和多西环素联用后,对副猪嗜血杆菌SH0165株和胸膜肺炎放线杆菌JL03株的FIC=0.75,均呈现协同作用,而和TMP联用后呈现无关作用。氟苯尼考和粘杆菌素联用对副猪嗜血杆菌SH0165株呈现无关作用,而对胸膜肺炎防线杆菌JLl03株却呈现协同作用。

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4讨论

4.1最近十余年,国内外学者对氟苯尼考开展了大量的体外抑菌试验,证实其对胸膜肺炎防线杆菌、猪链球菌高度敏感(马建云,焦库华,2005)。同时,经大量临床试验表明,氟苯尼考在治疗链球菌病和胸膜肺炎的效果也比较显著,在临床症状、肺病变计分、日增重、血清学试验等指标方面,效果优于其它抗菌药(席进华,杨金海,2005)。近年的研究发现,氟苯尼考对传染性胸膜肺炎的敏感性仍高于其它抗生素(delaFuente,2007)。但随着抗菌剂的大量使用甚至滥用,细菌耐药性日益严重,目前在部分猪场使用氟苯尼考等常用抗菌剂对副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌感染的治疗效果下降。因此,筛选具有协同作用或累加作用的抗生素组合,可以为临床确定合理的给药方案,不仅可以提高疗效和治愈率,还可以部分解决耐药菌株引起的感染,并且还可以防止耐药菌株的出现,延长抗生素的使用寿命,具有重要的理论和实践意义。

4.2本研究采用临床控制呼吸道疾病的最主要的抗生素氟苯尼考与其他常用抗生素联合使用,测定FIC判断是否具有协同作用。经过联合用药测定和计算,氟苯尼考与多西环素联合使用对副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌均具有很好的协同作用,与报道的氟苯尼考与多西环素联合使用对爱德华氏菌的抑菌效果呈现相加作用和对猪源大肠杆菌的抑菌效果呈现协同或相加作用,缩小耐药突变选择窗等结果相一致;氟苯尼考与粘杆菌素联合使用对胸膜肺炎放线杆菌也同时具有协同作用,与文献报道对猪大肠杆菌和链球菌具有协同作用的结果相似,而对副猪嗜血杆菌却呈现无关作用。因此这些结果提示在体内治疗由于副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌引起的感染时,两药联用或可减少氟苯尼考的用量或者减少多西环素的用量,或提高疗效。

4.3经试验测定,氟苯尼考和多西环素联合用药,对副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌的抑菌配伍比例均为4:1,可呈协同作用。氟苯尼考和粘杆菌素联合用药,对胸膜肺炎放线杆菌的抑菌配伍比例为4:1,也具有协同作用。在临床上按照此比例进行合理组合用药,可以很大程度上节约抗生素的使用量或大大提高疗效,节约治疗费用和成本;或者在同样使用剂量和浓度下更为有效杀灭和抑制耐药菌的感染。这对氟苯尼考等的实际应用、抗生素的联合使用或者复方制剂的研制具有重要意义。

致谢:

本试验所用的副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌为周锐教授提供,试验是在华中农业大学农业微生物国家重点实验室和兽医微生物与免疫实验室完成,因此一并表示感谢。

参考文献:

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